CTM 期刊 | 用腺结合病毒运载的 CRISPR/Cas9 系统敲低乳酸脱氢酶可以缓解原发性 I 型高草酸尿



        原发性 I 型高草酸尿(PH1;OMIM #259900)是最常见也最严重的 PH 亚型。PH1 的特征表现为高草酸尿和反复发作的尿路结石。PH1 是由丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(AGT)(EC2.6.1.44)基因发生突变引起的常染色体隐性疾病。在正常情况下 AGT 在肝细胞中高表达。AGT 的功能主要是催化乙醛酸转化为甘氨酸。AGXT 突变可以导致 AGT 脱靶,催化活性降低,AGT 表达降低或消失,进而可以导致乙醛酸聚积。聚积的乙醛酸可以在乳酸脱氢酶(LDH)(EC1.1.1.27)的催化下转变为草酸盐,从而出现反复发作中的尿路结石,肾功能下降,最终导致肾衰竭。PH1 患者在未成年时就极易发生肾功能不全或终末阶段的肾疾病(ESRD)。57% 的 PH1 患者在 40 岁之前发病。此外随着 PH1 疾病的进展,同时进行肾移植和肝移植将是 PH1 患者唯一的治疗选择。而同时进行肾移植和肝移植十分昂贵且风险性很大。因此目前急需新的可以持久有效治疗 PH1 的方法。



        2020 年 12 月 17 日,Clinical and Translational Medicine 杂志在线发表了 上海交通大学  Hongquan Geng  教授团队 的最新成果 “Knockdown of lactate dehydrogenase by adeno-associated virus-delivered CRISPR/Cas9 system alleviates primary hyperoxaluria type 1”[6] (  点击文末  “阅读原文”  下载 PDF 全文  )。

        PH1 是一种罕见的基因遗传性疾病。PH1 表现为内源性肝脏来源的草酸盐聚积,导致高草酸尿,反复发作的草酸性肾结石和终末阶段的肾疾病。因为 LDH 负责草酸代谢的最后一步,即在肝脏中催化乙醛酸盐转化为草酸盐,所以 LDH 是减少草酸生产的理想靶点。在本项研究中作者及其团队探讨了用 CRISPR/Cas9 技术特异性破坏肝脏 LDH 而对 PH1 产生的治疗功效以及可能的副作用。


         在体外用嗜铬细胞瘤(PC12)细胞检测 CRISPR/Cas9 剪切单导 RNAs 的功效。给新生 PH1 大鼠一次性注射腺相关病毒运载的、靶向 LDH 的  CRISPR/Cas9 系统。在注射 3 周后给大鼠进行肝脏活检,目的是检测肝脏 LDH 的表达,肝脏的损伤,肝脏的代谢等情况。常规监测尿内草酸盐水平。0.5% 乙二醇处理四周后评估大鼠肾脏草酸钙沉积情况。处理 6 个月后,处死大鼠,对多个肝脏以外的器官进行毒理学分析。        

        在实验组把 PH1 大鼠 20% 肝细胞内的 Ldha  基因敲除。结果表明与对照组相比,实验组 PH1 大鼠 LDH 的表达降低 50%。与对照组相比,尿内草酸水平有显著降低,肾脏内草酸钙沉积情况在治疗的整个 6 个月过程中一直在不断地下降。试验过程中并没有观察到 CRISPR/Cas9 相关的脱靶现象或者肝毒性等副作用。但是可以观察到肝脏内三羧酸循环(TCA)和糖酵解途径出现轻微的改变。


         结论是 CRISPR/Cas9 介导的 LDH 破坏具有持续时间长,编辑效率要求低等优势,可以作为缓解 PH1 治疗的新策略。

         总之本项研究表明中等程度地敲低 LDH 既可以限制草酸盐的合成,又能限制肝脏的代谢改变。进一步深入研究有助于阐明 LDH 敲低的结果。让人兴奋的是联合 LDH 破坏和 GO 破坏可以进一步降低草酸盐的分泌,使之甚至接近正常水平,因而可以避免疾病的进展和肾功能的损伤。随着测序费用的不断降低,人们可以早期诊断 PH1,并通过新技术(例如基因编辑)实现对 PH1 的早期治疗。

 

[阅读原文]

https://onlinelibrary.wiley.com/journal/20011326

REFERENCES

1. Cochat P, Rumsby G. Primary hyperoxaluria. N Engl J Med. 2013;369(7):649-658.

2. Salido E, Pey AL, Rodriguez R, Lorenzo V. Primary hyperoxalurias: disorders of glyoxylate detoxification. Biochim Biophys Acta. 2012;1822(9):1453-1464.

3. Hopp K, CogalAG, Bergstralh EJ, et al. Phenotype-genotype correlations and estimated carrier frequencies of primary hyperoxaluria. J AmSocNephrol. 2015;26(10):2559-2570.

4. Jiang D, Geng H. Primary hyperoxaluria. N Engl J Med. 2017; 376(15):e33.

5. Ben-Shalom E, Frishberg Y. Primary hyperoxalurias: diagnosis and treatment. Pediatr Nephrol. 2015;30(10):1781-1791.

6. Zheng R, Fang X, Chen X, et al. Knockdown of lactate dehydrogenase by adeno-associated virus-delivered CRISPR/Cas9 system alleviates primary hyperoxaluria type 1. Clin Transl Med . 2020;10:e261.

 



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